Construída entre os anos de 1717 e 1728, é um dos expoentes do Barroco Português e uma das mais ricas bibliotecas europeias. Ficará conhecida como Biblioteca Joanina em honra e memória do Rei D. João V (1707-1750), que patrocinou a sua construção e cujo retrato da autoria de Domenico Duprà (1725), domina categoricamente o espaço.

O Piso Nobre, terminado em 1728, começou a receber os primeiros livros depois de 1750, e atualmente o seu acervo é composto por cerca de 40.000 volumes. Toda a sua construção visa a conservação do acervo bibliográfico, desde a largura das paredes exteriores ás madeiras no interior. Ainda no auxílio à preservação dos livros, existem duas pequenas colónias de morcegos que protegem as coleções de insetos bibliófagos. Foi utilizado como local de estudo desde 1777 até meados do séc. XX, com a entrada em funcionamento da atual Biblioteca Geral.

O Piso Intermédio foi sempre o depósito da Casa da Livraria, o qual era vedado o acesso aos estudantes e outros funcionários – o acesso seria sempre e somente dos Bibliotecários. Era também o local onde se reuniria a Guarda Real Académica, que a partir daqui acedia à Prisão Académica, abaixo.

A Prisão Académica funcionou inicialmente em dois aposentos sob a Sala dos Capelos, logo em 1559 - desde a sua fundação que a Universidade teve como privilégio um código judicial próprio, aparte da Lei Geral do Reino. Estavam subordinados a este código, o “Foro Privado”, todos os que de alguma maneira se encontravam ligados à instituição. Esta autonomia permitia à Universidade possuir Juiz – o Magnífico Reitor -, Guarda e Prisão.

Em 1773 a Prisão foi transferida para o edifício da Biblioteca Joanina que viu incorporados e recuperados os restos do que fora o antigo cárcere do Paço Real, e que documentam a única cadeia medieval que ainda existe em Portugal. Em 1834, e após a extinção das Ordens Religiosas, a Prisão serviu como local de depósito de livros, manuscritos e iluminuras que se encontravam em diversos mosteiros e conventos.